简介
近年来，利用生理学上更为精准的 3D 细胞模型进行研究和药物发现的需求一直在稳步增长。研究人员一直在建立和维护各种 3D 细胞模型，以研究更多的疾病和生理机制 [1,2]。现在已经有能力突破一些限制因素，实现通过更快，更简单的操作完成复杂实验，尤其是针对珍贵的，从患者身上分离的样本。细胞球和类器官的形成，处理，染色过程通常是繁复的操作过程，容易造成样本的破坏或丢失。此外高内涵成像也具有一定的挑战性，因为类器官更倾向于生长在孔的边缘，或定位在孔内不同的位置和高度上。且在多孔板中进行药物处理和分析时，每个孔的读数是有限的。
新技术正在快 速 的发 展以简化 和 促 进 流 程 的完 善。我 们 使用 微 流 体 设 备 Pu·MA System 3D MAG and 3D flowchips(Protein Fluidics)，和磁性包被的 3D 细胞模型完成自动化的实验流程 ( 图 1 )。3D 细胞模型用磁性纳米颗粒包被NanoShuttle ™ [3]，被转移到孔内并通过嵌入流体芯片的磁铁定位到孔中央。自动化的微流体系统可以实现培养基自动更
换，化合物添加以及微组织的处理。然后使用 ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System (MolecularDevices) 拍摄高分辨率的 3D 结构并使用先进的分析软件定量细胞球体和类器官的形态及化合物的影响。
我们利用自动化工作流程完成了两个复杂的 3D 实验：
• 药物处理，染色，以及 3D 肿瘤细胞球的分析：HeLa 细胞球被化合物处理 24-48 h。自动对其进行活性染色并检测化合物处理后的浓度响应曲线。
• 评价药物灵敏性和生物标志物的免疫荧光分析：三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者上分离的类器官 (PDOs) 用于检测药物反应。PDOs 使用 IF 标记物染色并在流体芯片内成像 [4]。
优势
• 自动化微流体控制简化复杂的 3D 实验
• 利用包被磁性涂层的 3D 细胞模型和自动化分析工作流程克服了常规 3D 实验操作的缺点
• 从分泌因子分析到高内涵图像分析，测量多个分析参数
Pu·MA System and 3D MAG 工作流程
Pu·MA System and 3D 流体芯片针对流线型自动化类器官实验而设计。Pu·MA System and 3D MAG 包括标准的 Pu·MASystem 仪器，该设备经过 3D MAG 修改，使磁涂层的 3D 细胞模型在检测步骤中保存在受保护的样品室中 ( 图 1,2 )。3D 球体的 NanoShuttle 处理是根据 Greiner Bio-One(3) 的方案进行的 [3]。在这里，我们展示了这种生物打印与我们的自动化分析系统的一个新用途。
磁化的 3D 细胞模型在装载托盘的帮助下被转移到流体芯片中，该托盘包含小的 ( ~1 毫米直径 ) 磁棒，并确保涂有磁性纳米颗粒的类器官的中间定位 ( 图 2 )。然后将流体芯片放入系
统的培养箱内。Pu·MA System 的架构是使用气体来移动液体，在环控室内对样品腔提供气体交换。流体芯片外观与传统的微孔板形式相似 (384-well spacings SLAS/ANSI standard)，适用于多通道或自动化液体工作站。板子底部透明，可用于任何荧光或高内涵成像系统 ( 图 1 )。此外，在整个检测过程中，磁性涂层 3D 模型能够保持在中心位置，从而促进了所有样品孔的同一采集区域的自动化。ImageXpress Micro Confocal 系统强大的自动对焦功能，更有助于获取每个样品孔中整个球体或类器官的高分辨率图像。
3D 肿瘤细胞球的药物处理，染色和成像
使用微流体样本处理流程和磁珠应用于 HeLa 细胞球的活性和死亡检定，以反映药物处理对目标细胞带来的毒性影响。 按照 Greiner Bio-One 的方法 [5]， 以每孔 2000 个细胞的密 度将 HeLa 细胞磁性生物打印到 384 孔 板 上，涂有NanoShuttle 涂层的 HeLa 细胞，在 37℃ , 5% CO2 的条件下在磁性保持驱动器上培养 1 小时。然后将平板放在培养箱中一天，再将形成的球体转移到流体芯片孔中，并使用 Pu·MAsystem 3D MAG 进行下一步处理。
在下面的实例中，HeLa 3D 细胞球通过自动化加药的方式给与不同浓度的化合物处理 22 小时 (staurosporine，0 - 10 µM)，然后将培养液更换为染色液 (Calcein AM, Hoechst and Ethidium Homodimer 1)，染色完成后用 PBS 清洗样本。经过处理后，从仪器中取出流体芯片，并用 ImageXpress Micro Confocal Imaging system 对流体芯片成像。拍照时使用 10x 或 20x 物镜，在 510 µm 内使用 3D Z 轴拍摄 12-20张图片，得到的 2D 投影图像用 MetaXpress High-Content Image Acquisition and Analysis Software 中 的 CME 模 块进行分析，快速的定量细胞活性 ( 图 3 )。在 staurosporine 处理下的活死细胞个数也通过 MetaXpress 软件进行定量。2D 投影图片和 3D 图像的活死细胞分析均可以使用 CME 分析模块进行分析。
体外药物灵敏性实验以及原发肿瘤 3D模型的生物标志物检测
如前所述，病人来源的类器官 (PDOs) 由 TU-BcX-4IC ( 来自原发性三阴性乳腺肿瘤的细胞 ) 生长成紧密球体 [4]。这里，我们进一步优化了方法，使用微孔板样式的板子形成类器官，使用 24 孔 AggreWell ™ 400 微孔板中的一个孔以生成大约1200 个大小一致的 PDOs。为了制造类器官，将 TU-BcX-4IC细胞以每孔 2000 个细胞的密度种上，并培养 2 天，以形成致密的 3D 类器官，在孔中加入 100 μl NanoShuttle，将类器官与 NanoShuttle 一起孵育 3 小时，然后将 PDOs 转移到流体芯片中。本研究中使用的药物为 romidepsin 和 trametinib，不同浓度药物处理 3D 类器官 48 小时，后在 Pu·MA System3D MAG 中进行自动药物处理和免疫荧光染色。对活细胞进行如上所述的活性染色 (Calcein AM, Hoechst 和 Ethidium Homodimer 1 )， 然 后 用 ImageXpress Micro Confocal 对样本进行成像。
微图案板形成的类有机化合物，使用 24 孔 AggreWell ™ 400微 孔板中的单个孔， 我 们可以生成大约 1200 个尺寸一致的 PDOs。为了制造类器官，将 TU-BcX-4IC 细胞以每微孔2000 个细胞的密度铺上，并培养 2 天，以形成致密的 3D 类器 官。在孔中加入 100 μl NanoShuttle， 将类有机物质与NanoShuttle 一起孵育 3 小时，然后将 PDOs 转移到流芯片中。本研究中使用的药物为 romidepsin 和 trametinib，不同浓度药物处理 3D 类器官 48 小时，然后在 Pu·MA System3D MAG 中进行自动药物处理和免疫荧光染色，对活样本进行如上所述的活性染色 (Calcein AM, Hoechst 和 EthidiumHomodimer 1)，然 后用 ImageXpress Micro Confocal system对样本进行成像，用 MetaXpress 软件中的活死细胞分析模块对其进行分析 ( 图 4A 和 4B )。图像以共焦焦 z 轴叠加的方式获取，然后将叠加的图像合成 2D 投影图像，用于细胞活力分析。生成多参数数据点并分析浓度响应曲线 ( 图 4B )。
通过分析测定活细胞和死细胞的百分比，并用于获得化合物的有效浓度。然后对样品进行固定并保留特异性标记E-cadherin 和 CD44。romidepsin 处理后在 Pu·MA System 中进行 PDOs 特异性标志物的免疫荧光染色。PDOs 在药物处理后 E-cadherin 和 CD44标志物的检测结果在图 5C。共聚焦图片通 过 ImageXpressMicro Confocal Imaging system 获得。该结果显示药物处理后 PDOs 被破坏且 E-cadherin 表达下降。
结论
我们介绍了改进的实验流 程，在 Pu·MA system 3D MAG 上使用磁性涂层 3D 细胞微组织， 然后使用 ImageXpress MicroConfocal system 进行高内涵成像与分析。这种联合工作流程提高了以下方面：自动化的类器官实验流程、细胞球处理，分泌因子的原位培养基取样，药物处理和多参数分析，以及生物标志物的免疫荧光染色。使用简化的工作流程和 Pu·MA system 模板，我们用不同的药物和浓度对不同的 3D 细胞模型进行染色和成像。我们演示了自动化药物处理、样本染色和处理，以及通过成像分析活性、标记物表达和表型变化，可用于快速评估 3D 肿瘤样本的药物敏感性。