简介
从研究疾病到评估药物和环境化合物诱导的毒性反应，基于细胞的测定法通常聚焦于线粒体，旨在监测细胞健康。线粒体功能是整个细胞健康的关键指标，线粒体功能障碍与多种疾病 ( 包括帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，心力衰竭，局部缺血性疾病和癌症 ) 的关联密切相关。 1 此外，罕见疾病的发病机制可能由编码线粒体蛋白的基因或线粒体 DNA 中的突变驱动。 1
在整个药物开发和测试过程中，评估线粒体功能是至关重要的。恢复线粒体功能的疗法的发展和靶向癌症线粒体功能障碍的化疗药物的发展就是例证。 3 此外，线粒体功能的评估是临床前药物安全性评估中至关重要的一步，因为线粒体功能障碍可能由药物触发，进而对细胞和组织健康产生不利影响。测量线粒体膜电位 (MMP) 以监测线粒体代谢活性的变化是一种评估线粒体功能的灵敏且有效的方法。线粒体膜电位是检测凋亡过程中线粒体去极化，检测多药耐药细胞以及评估各种毒性筛选中线粒体功能的重要工具。 1-2 MMP 的评估通常使用亲脂性阳离子荧光染料进行。 根据线粒体膜电位的状态，MITO-ID® 膜电位染料的荧光会发生变化。具体来说，细胞质中它以单体形成存 在，发出绿 色荧 光 (FITC, 530 nM)；在活性线粒体中，它在线粒体基质中聚集而发出橙色荧光 (TRITC,570 nM)。当 MMP 被破坏时，MITO-ID 染料退出去极化线粒体，而以单体形式存在，可以观测到橙色荧光降低到消失。我们利用 MITO-ID 染料进行了两项线粒体毒性实验，以评估化合物处理后线粒体膜电位的变化。对悬浮癌细胞系 SJK 和贴壁癌细胞系 U2OS 进行了检测，以证明 MITO-ID 染料可用于评估多种细胞类型的 MMP，以及 ImageXpress Pico® 自动细胞成像系统强大的成像和分析能力。
实验材料
• SJK cells (ATCC, cat. #CRL-1644 ™ )
• U2OS cells (ATCC, cat. #HTB-96 ™ )
• MITO-ID 线粒体膜电位检测试剂盒 (Enzo Life Sciences, cat.#ENZ-51018)
• Hoechst 33342 (Enzo Life Sciences, cat. #ENZ-52401)
• 96 well, clear suspension culture microplate (Greiner BioOne, cat. #655185)
• 96 well black wall, μClear® microplate (Greiner Bio-One,cat. #655090)
• ImageXpress Pico 自动细胞成像系统及 CellReporterXpress图像获取和分析软件
实验方法
悬浮和贴壁癌细胞中的线粒体毒性测定
悬浮细胞
将 SJK 细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种到 96 孔悬浮细胞板中。用 CCCP 的 1：3 稀释液 ( 2.5 nM 至 50 µM ) 处理细胞 30分钟。化合物处理做三个复孔。处理后，将细胞离心分离，除去上清液，将细胞重悬并在 1X Assay Buffer 中洗涤。 将细胞再次离心，并在添加 MITO-ID 和 Hoechst 33342 染色溶液之前除去上清液。 在 1X 分析缓冲液中制备1μL/mL 的 Hoechst，制备 10 μL/mL 的 MITO-ID 膜电位检测试剂。将细胞与染色溶液在黑暗中于室温孵育 15 分钟，然后立即在ImageXpress Pico 系统上以 40X 放大倍率成像。 每孔 42 个位点，用透射光以及 DAPI，FITC 和 TRITC 荧光通道进行拍摄。在孔内不同深度处收集图像，以确保所有悬浮液中的细胞都处于聚焦状态。这是通过捕获称为 Z-stack 的一系列图像来完成的，并将该系列图像实时组合为单个 2D 投影图像。Z-stack 采集是五个平面的小堆叠，2 μm 的聚焦步长。 生成了来自 Z-stack 的最佳聚焦 2D 投影图像，并将其用于分析。
贴壁细胞
将 U20S 细胞以每孔 8,000 个细胞的密度接种在黑壁底透 96孔微孔板中。将板在 37℃，5％ CO2 下孵育过夜。从 50 µM CCCP和 100 µM Antimycin A 开始，用 CCCP 或Antimycin A 以 1：3稀释液处理细胞。 一式四份进行化合物处理。 处理一小时后，将化合物溶液从孔中移出，并将细胞在 1X Assay Buffer 中洗涤一次。按照制造商的说明步骤，在 1X 分析缓冲液中以 10μL/mL 的浓度制备 MITO-ID 染色溶液，并以 1 μL/mL 的浓度加入Hoechst 33342。将板与染色溶液在室温下孵育 30 分钟，然后用 HBSS (2X) 洗涤。使 用 ImageXpress Pico 系统的 20X 物镜采集图像，并通过实时拼接程序在每个孔中捕获六个位置。在采集中使用 DAPI，FITC 和 TRITC 荧光通道，其曝光时间分别为10 ms，200 ms 和 200 ms。
实验结果
定量 CCCP 对 SJK 细胞线粒体膜电位的表型效应SJK 细胞，即小鼠骨髓瘤 B 淋巴细胞系，用强效氧化磷酸化抑制剂 CCCP ( 质子离子载体 ) 处理，处理后用 MITO-ID 膜电位检测试剂盒和 Hoechst 33342 核 染料染色。MITO-ID 染料的荧光发射差异可以通过自动成像和分析进行可视化和量化。 在有活力的细胞中，染料以绿色 (FITC) 荧光单体的形式存在于细胞质中，同时形成聚集体，在具有完整 MMP 的活性线粒体中发出橙色 (TRITC) 的荧光 ( 图 1 和 2 )。线粒体膜电位的分析是使用 CellReporterXpress® 图像采集和分析软件中的 3 通道多波长细胞评分应用模块进行的。根据细胞核染色计数细胞，并为FITC 信号，TRITC 信号或两个荧光信号评分为阳性或阴性。同时表达 FITC 和 TRITC 荧光分子以及仅 TRITC 聚集体的 SJK 细胞被认为是有完整的线粒体膜电位的阳性细胞 ( 图 2A-E )。通过分析生成了多参数读数，包括一种或两种荧光标记均为阳性的细胞数量和百分比，或者无荧光标记的细胞数量和百分比，细胞和核面积测量以及两种荧光标记 ( FITC 和 TRITC ) 的强度测量。
随着 CCCP 浓度的增加，极化线粒体中橙色 TRITC 聚集体阳性细胞的百分比降低，对 MMP 具有明显的剂量依赖性效应 ( 图2E )。在较高浓度的 CCCP 中，总 TRITC 信号强度的降低与胞浆绿色荧光强度的升高相结合，也表明线粒体功能丧失 ( 图 2F )。在最高的三个浓度下，绿色 FITC 信号开始在细胞中减少，表明这些浓度的 CCCP 的毒性作用。
U2OS 细胞中线粒体膜电位的多参数分析
用已知的氧化磷酸化抑制剂 CCCP 和 Antimycin A ( 线粒体呼吸链复合物 III 抑制剂 ) 处理 U2OS 贴壁细胞后，线粒体膜电位表现出显著的剂量依赖效应。通过 CellReporterXpress 软件中的线粒体分析模块对此进行了评估，该模块被用来基于细胞核染色定量总细胞数，橙色 TRITC 荧光聚集体的数量代表了有完整MMP 的有活力的线粒体。随着两种化合物浓度的增加，每个细胞的平均 TRITC 聚集体计数减少，聚集体的 TRITC 信号强度降低，这表明线粒体膜电位的损失 ( 图 4 )。
结论
我们展示了一种高度敏感的阳离子荧光染料 (MITO-ID) 的应用方法，通过自动成像来可视化和分析线粒体膜电位的变化。通过染料发射光谱的变化以及多参数数据的分析，可以直观地看到线粒体膜电位的变化。综上所述，ImageXpress Pico 系统结合 MITO-ID 膜电位检测试剂盒被证明是监测悬浮和贴壁癌细胞系线粒体膜电位变化的重要工具。这些数据还突出了这种线粒体膜电位测定法在临床前药物安全性评估以及化学 / 环境毒性筛选中监测线粒体功能的实用性。