高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是最普遍和最致命的卵巢癌类型，占卵巢癌死亡率的 70% - 80%^[1]。由于低培养成功率和新鲜肿瘤材料来源的局限性，在体外建立稳定的高级别卵巢癌类器官（HGSC）是非常困难的。来自丹麦的哥本哈根大学生物技术研究与创新中心的 Senkowski 等人提出了一种从冷冻保存组织中长期培养 HGSC 的方案，以提高类器官培养成功率，并提供类器官表型鉴定及类器官药物反应与临床结果相关联的见解。基因组、组织学和单细胞转录组学分析显示，此种方法培养的类器官概括了原始肿瘤的遗传和表型特征，这将有助于 HGSC 类器官在基础和转化卵巢癌研究中的应用。此项工作在 2023 年 6 月 19 日发表在《 Development Cell 》上。

 

图1 摘要图示

 

亮点

01 建立了 HGSC 类器官长期培养的方法

02 两种新配方培养基可提高类器官培养成功率

03 体外培养的 HGSC 类器官保留了原始肿瘤的基因组和表型特征

04 培养基培养的类器官的药物反应与临床结果具有相关性

 

图2 两种新培养基的开发过程及其支持更高的 HGSC 类器官培养成功率

 

首先，团队优化了新的培养基 M1 / M2。作为培养基优化的起点，团队使用高级 DMEM / F12 培养基，补充谷氨酰胺、伯莫辛、N- 乙酰半胱氨酸和 B27 补充剂，形成基础培养基。然后，评估了成纤维细胞生长因子 FGF-10、p38 抑制剂 SB202190、TGF-b 受体抑制剂 A83-01、EGF、FGF-2 或 Noggin 等对类器官形成的影响^[2]，最终选择继续使用基础培养基，补充  FGF-10、SB202190 和 A83-10 进一步优化形成培养基 M0.1。

 

培养基 M0.1 可以促进类器官的生长，但不能维持传代的生长。因此，团队着手将培养基进一步优化。发现添加 FGF-4 导致传代过程中类器官形成增加，形成培养基 M0.2。接下来，在 M0.2 中补充 b- 雌二醇增加了 HGSC 类器官的形成和传代生长，形成培养基 M0.3。在接下来的实验中，添加烟酰胺进一步改善了类器官的形成^[3]。经过对烟酰胺浓度的摸索，团队在最终的 HGSC 类器官培养基配方中加入了 5 mM 烟酰胺，形成培养基 M1。在培养基 M1 中添加 EGF、Heregulinβ-1、氢化可的松和佛司可林，形成培养基 M2。M2 可以促进或限制类器官生长，但具体取决于样品。因此，为了最大限度地提高类器官成功生长的可能性，每个 HGSC 样品应在两种不同的培养基 M1  和 M2 中平行培养。

 

团队发现，使用 M1 / M2 的类器官培养方法可得到比以前发表的方案更高的 HGSC 类器官培养成功率（图2）。

 

图3 基因组及转录组表明，培养的类器官概括了原始肿瘤的遗传和表型特征

 

利用 M1 / M2 培养基，团队总共开发了 17 种稳定的  HGSC 类器官培养物，其中通过 M1 培养的有 7 种， M2 培养的有 10 种。达到持续扩增阶段所需的时间因类器官培养物的不同而不同，从 26 天到 18 天不等，平均为 89 天。所有类器官培养物均被冷冻保存，并在复苏后恢复生长。值得注意的是，HGSC 类器官在不同患者间和同一患者来源的培养中表现出形态异质性。比如，EOC677_pAsc 类器官生长为小而密集的聚集体，而同一患者 EOC677_rAsc 和EOC677_r2Asc 形成松散聚集的囊性结构。其他观察到的结构包括球状聚集体（EOC172_rAsc 或 EOC733_iOme）或大的、不规则的、密集的聚集体（EOC733_pPer、EOC1120_pOme 或EOC1120_rAsc）。为了将类器官的内部表型与相应患者样本的内部表型进行比较，进行了苏*精伊红和  IHC 染色。总体而言，类器官表现出匹配肿瘤上皮的形态学特征，包括腺状生长和严重核多形性。IHC 标记物的表达也一致，并且显示出更均匀的染色强度和更高的标志物阳性细胞百分比。

 

HGSC 类器官在长期培养中保留了患者样本的基因组特征和转录组特征。团队进行了 WGS 分析，以研究类器官是否概括了原始患者肿瘤的基因组图谱。类器官表现出与原始患者样本非常高的突变一致性。又进行了拷贝数变异（CNV）分析，得出类器官在长期传代中保持原始肿瘤的 CNV 谱（图3）。总体而言，目前的类器官概括了患者间基因组异质性，并准确地反映了疾病的演变。为了弄清楚稳定、长期的 HGSC 类器官培养物在单细胞水平的转录特征是否可以代表患者肿瘤，团队对来自 5 名患者的类器官样本进行了  scRNA-seq （图3）。几乎所有来自类器官的细胞都被归类为癌细胞。这些数据表明类器官在单细胞水平上与原始肿瘤样本在转录上高度相似，与类器官的基因组表征一致。

 

图4 基于高内涵的类器官药物反应分析流程

 

最后，团队对 11 种类器官培养物进行了药物反应分析，以研究类器官药物反应是否与先前在临床患者中观察到的药物反应相关。为了高通量进行实验，团队将悬浮在基底膜提取物中的类器官片段接种到超低附着的 384 孔微孔板中，并用适合样品的生长培养基覆盖培养物（图4）。细胞培养条件包括葡萄糖、谷氨酰胺和其他营养素的非生理浓度，可以极大地影响功能测定中的药物反应^[4,5]。为了探索培养条件是否会影响类器官药物反应与临床反应之间的相关性，团队在类器官生长的初始阶段后将生长培养基更换为一半的种子板中的生理性人血浆样培养基 HPLM。HPLM 模拟人血浆的代谢组成，为评估药物反应提供了更具生理相关性的环境^[6]。

 

图5 基于图像的细胞毒性测定

 

团队将生长培养基和 HPLM 培养基中的类器官暴露于一组用于 HGSC 临床治疗的药物，通过死细胞荧光染色和高通量共聚焦成像评估了细胞毒性（图5）。药物作用后，类器官中的细胞核用 Hoechst 33342（蓝色，细胞核）染色，死细胞用细胞毒素绿（绿色）染色。使用高内涵对类器官进行成像，并使用图像分析软件估计死细胞百分比。

 

HGSC 类器官药物反应与临床结果的相关性取决于培养基，建议进一步研究使用基于类器官的测定和生理样培养基来预测临床结果。高内涵成像技术在类器官药物筛选和优化培养基条件中，由于其成像及分析的通量优势，节省了大量人力和时间，为转化医学研究提供了新的思路和方法。

 

参考文献

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[2] Hill, S.J., Decker, B., Roberts, E.A., Horowitz, N.S., Muto, M.G., Worley, M.J., Jr., Feltmate, C.M., Nucci, M.R., Swisher, E.M., Nguyen, H., et al. (2018). Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patientderived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8, 1404–1421. https:// doi.org/10.1158/2159-8290.CD-18-0474.

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