简介
单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 是一种用于对复杂细胞 和组织样本中的基因表达进行无偏差表征的技术。尽管 scRNA-seq 彻底改变了现代生物学，但在技术上仍然具 有挑战性，并且通常成本高昂。目前市场上的解决方案能够在拥有数万个细胞的初始池时对一小部分细胞进行有效分析。然而，处理稀有细胞群的 scRNA-seq 文库制备 的简化方案仍然缺失。 在这里，我们开发了一种新型孔板检测法，用于性价比 高且高度 敏 感的 scRNA-seq。该工作流 程 支 持 来自稀 有细胞群的稀有样本文库制备。在此新工作流程中 ( 图 1 )，我 们 使 用 了 DispenCell 和专用检测吸头 ( SEED Biosciences，瑞士 )，与专用和优化的单细胞文库制备系统 ( MERCURIUS 高灵敏度 BRB-seq 试剂盒，Alithea Genomics，瑞士 )。
单细胞分配
首先，在测序文库制备之前，我们测试了 DispenCell 在专用裂解缓冲液中分配单细胞的能力。淋巴细胞系从冷冻的小瓶中解冻，传代两次，然后在单细胞悬浮液中收 获。使 用 10 μm 细胞过滤器 ( Miltenyi Biotec，德 国 ) 过滤细胞，计数并在无 RNAse 的甲基纤维素分配溶液 (DispenMe、SEED Biosciences) 中 稀 释 至 最 终 浓 度 为 2×104 cells/mL。 然 后，使 用 DispenCell 传感吸头从细胞悬浮液中装载 200 个 细 胞。设 置 DispenCell 将单细 胞分配 到 384 孔 板，孔板预装 4.2 μL 裂解缓冲液 ( HS BRB seq 试剂盒， Alithea Genomics )。前 96 个孔 分 配 大 约 7 分钟。然 后，停止分配，因为我们有足够的样品进行下游分析。
单细胞质量控制
分配后，我们立即使用 SEED Biosciences 开发的软件 DispenSoft 进行单细胞质量控制后处理。孔板的每个孔 用颜色编码的矩阵表示 ( 图 2.a)。 当孔中含有单个细胞时，软件将其标记为绿色，而红色 孔中则含有零个或多个细胞，应丢弃。为了区分碎片和细 胞，通过对基于大小的直方图进行门控来设置阈值 ( 图 2.b )。只有高于阈值的峰才算作细胞。
在这里，我们获得了 77 个单细胞孔 ( 80% 单细胞分离 率 )。使用 DispenSoft，原始阻抗数据也可用于记录过程。可手动检查每个阻抗曲线。单尖峰是单细胞的特征 ( 图 2.c ) 而多个细胞产生多个峰。这表明 DispenCell 能 够以简单、快速和完全可追溯的过程在裂解缓冲液中分 配单细胞。