三阴性乳腺癌是一种具有临床侵袭性的肿瘤亚型, 具有高转移率, 复发率和耐药性。目前还没有临床批准的针对这种疾病的小分子靶向疗法, 所以发现新的治疗靶点有着迫切需要。源自患者的基于细胞的3D 癌症模型是癌症研究,药物开发和个性化医疗的非常有价值的工具。原代肿瘤衍生模型可以概括肿瘤异质性和形态, 以及复杂的遗传和分子组成, 从而加速药物开发和药物测试。然而, 执行 3D 检测的复杂性仍然是采用这种化合物筛选方法的障碍。
在本研究中, 我们描述了一种成像和细胞培养方法的自动化, 这些方法可以批量进行复杂的基于3D细胞的实验。我们开发了一个整合的工作单元, 其中包括一台IXM-C HT.ai共聚焦成像系统,一台自动化CO2培养箱, 一台自动化移液工作站(Biomek i7),和一台协作机械臂。 工作单元流程设置能通过高内涵成像实现化合物测试自动化, 培养监测, 以及药物表型效应的评价。 肿瘤类器官由分离自患者来源的肿瘤TU-BcX-4IC原代细胞形成, 该外植体代表具有三阴性乳腺癌亚型的化生性乳腺癌。在与化合物一起孵育期间, 每天使用透射光成像监测肿瘤类器官,借助基于机器学习的图像分析, 可以表征肿瘤类器官的大小, 直径, 完整性和光密度。对于终点测定, 肿瘤类器官用细胞活性染料染色并使用自动共焦成像系统成像。我们表征了多个可用于研究肿瘤表型和化合物效应的定量参数,包括大小和完整性, 细胞形态和活力, 以及确定各种细胞标志物的存在和表达水平。

产生肿瘤类器官和PDX类器官的方法 (PDXO) 如之前所述(Matossian 等人2021)。 将原发性肿瘤样本植入SCID/Beige小鼠体内并表现出快速的肿瘤生长, 14 天达到最大肿瘤体积>1000 mm3, 然后从 2D 培养中扩增的样本中生成细胞系。 肿瘤类器官由2D扩增的 4IC 细胞形成的。 4IC 细胞每孔铺约2000个 (在U 型底低吸附384 板中, Corning) 并孵育48小时, 直到它们形成紧密的肿瘤类器官。 4IC 细胞使用带补充葡萄糖的Advanced DMEM培养基培养含有 NEAA,2mM 谷氨酰胺和胰岛素 120μg/L, 10% FBS (Gibco12491-015)。 对于代谢测定,类肿瘤用DMEM + 10% 透析血清培养(2mM 谷氨酰胺,5mM 葡萄糖,无酚红)。

细胞监测和成像
在 ImageXpress Confocal HT.ai 高内涵成像系统(MolecularDevices)上使用 MetaXpress 高内涵图像分析软件采集荧光图像和透射光 (TL) 。 肿瘤类器官图像在 TL 中获得, 间隔约
60 μm。 Z-图片组图像是通过 10X 或 20X 物镜使用共聚焦模式获得的。使用MetaXpress或 IN Carta™进行分析。
细胞培养自动化和成像流程
类器官的自动成像和分析对于定量评估类器官的表型变化以及增加实验和测试的通量非常重要。我们构建了一个自动化的集成系统, 可以自动监测, 维护和表征类器官和干细胞的生长和分化, 以及测试各种化合物的效果。自动化系统包括 ImageXpress Confocal HT.ai 系统和分析软件, 自动化CO2 培养箱, Biomek i7移液工作站, 机械臂和轨道。 由GreenButton Go 解决方案实现机械自动化。

原代样本→ SCID 小鼠→2D 扩增 →3D 微组织 →化合物库筛选

Figure 1. A.肿瘤类器官形成在铺板后48h, TL图像 (10X)。 B.化合物处理后的培养的肿瘤类器官。 C.肿瘤类器官使用
E-cadherin(绿色), CD44(红色)和Hoechst染色,共聚焦图像, 20x。 D.肿瘤类器官以化合物处理5天然后用Hoechst染料(蓝色), 钙黄绿素AM (绿色) and EtHD
(红色)染色, 10X物镜,类器官以共聚焦选项成像, 15张图像的Z-图片组每张间隔10 µm,展示的是最大投影叠加图像。 使用Custom Module Editor
(MetaXpress软件)分析识别类器官,细胞核,活细胞和死细胞。

细胞培养, 化合物处理和成像自动化
Biomek自动化用于化合物稀释, 细胞处理和染色。 然后每天通过自动成像培养和监测肿瘤类器官。通过基于AI的图像分析自动检测和表征肿瘤表型,密度和大小。对于终点法测定, 细胞用Hoechst,钙黄绿素AM 和EtHD的组合染色,并使用Custom Module Editor进行分析,以进行复杂的表型分析。
鉴定来自NCI 库的靶向针对化生性三阴性乳腺癌肿瘤类器官的化合物
3D 肿瘤类器官培养为疾病建模和化合物效应评估提供了非常有用的工具。自动化的工作流程允许大批量合物筛选分析, 并提高了分析的重现性和简便性。肿瘤类器官的自动成像和分析对于定量评估肿瘤类器官的表型变化和监测生物反应的复杂性很重要。来自成像的多种参数结果包括肿瘤类器官的大小, 完整性(面积), 不同标志物的密度, 细胞计数和其他特征。
我们以5个浓度10X梯度稀释测试了NCI库中1 68 种化合物的效果: 10nM, 100nM, 1000nM (1μM), 10μM和1 00μM。然后, 我们使用肿瘤类器官完整性 (肿瘤类器官面积)和活力(活细胞%)的评估来识别不同浓度下的Hits化合物。鉴定出了几种药物, 这些药物显示出了其靶向对传统癌症治疗耐药的肿瘤亚型的功效。下面列出的药物显示了其在指定浓度下对类肿瘤表型的功效(较高浓度也包括列出的较低浓度有效的药物)。

Figure 2. A. 3D癌症微组织的自动图像分析是使用透射光图像 (10X)和In Carta软件中基于AI的图像分析完成的(分析图例以紫色表示)。 B.使用
ImageXpress软件的Custom Module Editor功能进行荧光图像的终点法分析。 显示图像和分析图例。 对细胞评价和类器官表征进行了多次测量。

在指定浓度下有效的化合物列表：

所选化合物的剂量反应和次级表征
选择一组化合物进行二次后续分析。化合物在 1-10000 nM 范围内7个浓度进行了测试。 EC50值由使用肿瘤类器官解体度测量来确定的。
结论
• 我们展示了使用源自原代三阴化生癌细胞样品的3D肿瘤类器官的化合物筛选实验。我们测试了NCI库中的168种化合物,涵盖了多种浓度, 并确定了几种在3D细胞实验中显示出功效的化合物。
• 通过整合的自动成像系统, 移液工作站, 自动培养箱和协作机械臂, 使肿瘤类器官检测和化合物处理过程自动化。 这些仪器实现了对3D细胞模型进行自动化细胞培养, 维护和化合物处理, 而使这些3D模型可用于癌症生物学化合物筛选。
• 共聚焦成像与3D分析相结合, 可以对类器官内的细胞进行复杂的定量分析,并对具有不同表型的细胞进行计数和测量。该方法可用于测试抗癌化合物的效果和疾病建模。