简介
双链 DNA 通常通过测定 DNA 溶液在 260 nm 处的吸光度在酶标仪中进行定量。然而，该方法在典型的光吸收酶标仪上只能测量到约 250 ng/mL。对于涉及小样本的生物应用，如下一代测序和 DNA 扩增产物的定量，需要更敏感的方法。来自Thermo Fisher Scientific 公司的 Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒对 DNA 更特异，比传统光吸收方法的灵敏度高约1000 倍。 如产品手册所述，此实验在微孔板格式中采用单一染料浓度的动态范围从 250 pg/mL 到 1000 ng/mL。在这里，我们证明了使 用 Molecular Devices 公司 SpectraMax
酶标仪和 Quant-iT PicoGreen 实验，用户可以可靠地测量低至 50 pg/mL 的双链 DNA 浓度。为了最大化实验的灵敏度，需要使用最佳的激发和发射波长。与基于滤光片的酶标仪不同，SpectraMax iD5 多功能酶标仪和其他 SpectraMax 酶标仪中的双单色器允许在酶标仪规定的范围内选择任何波长。确定为实验提供最佳灵敏度和动态范围的激发和发射波长是很重要的，因为这些波长可能与基于滤光片的酶标仪使用的波长以及试剂盒手册中推荐的波长有所不同。
优势
• DNA 荧光定量灵敏度可低至 50 pg/mL
• 线性动态范围跨越四个数量级
• 预置在 SoftMax Pro 软件中的实验检测方案使结果易于分析
材料
• Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒 (Thermo FisherScientific cat. #P7589)
• 96- 孔全黑微孔板 (Greiner Bio-One cat. #655076)
• 避光黑色微管 (Argos cat. #T7100BK)
• 酶标仪 ( 注 : 这里没有列出的其他 SpectraMax 酶标仪对PicoGreen 的实验具有类似的性能 )
• SpectraMax® iD5 多功能酶标仪 (Molecular Devices cat.#iD5)
• SpectraMax® i3x 多 功能酶标仪 (Molecular Devices cat.#i3x)
• SpectraMax® M5 多功能酶标仪 (Molecular Devices cat.#M5)
• SpectraMax® Gemini ™ EM 酶标仪 (Molecular Devicescat. #EM)
方法
仪器和方案设置
• 打开酶标仪。
• 启动 SoftMax®Pro 软 件， 并从实验方案下拉菜单中打开PicoGreen 荧光方案。根据您使用的 SpectraMax 酶标仪，您可能需要输入检测的优化设置 ( 见表 1 )。
• 通过点击“Settings”，在屏幕的左侧选项选择要读取的孔和检测孔板类型。
• 点击模板按钮，打开一个窗口，您可以将微孔板的孔分配到预先设置的模板组。使用下拉菜单选择适当的模板组。PicoGreen 荧光方案中有预先设置的模板组，包括标准品、未知样品和未知 _NoDiln( 用于未稀释的样品 )。将孔分配给预设的模板组，用读取微孔板时获得的相应数据填充方案中的组表。
实验准备
该方法遵循 QuantiT PicoGreen dsDNA 试剂和试剂盒产品信息表的说明，除了实验体积从 2.0 mL 按比例减少到 200µL，以适应 96 孔微孔板格式。
• 用无 DNA 酶的蒸馏水将试剂盒中的浓缩缓冲液稀释 20 倍，制备成 1X TE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)。
• 将浓缩 DMSO 溶液稀释 200 倍，在 TE 缓冲液中配制 QuantiT PicoGreen 试剂的工作水溶液 ( 如上所述 )。建议在塑料容器中配制溶液，而不是在玻璃容器中，因为试剂可能会吸附在玻璃表面。用棕色或黑色的试管，或用箔片覆盖以保护溶液不受光。该溶液应在配制后的几个小时内使用。
• DNA 标准曲线 : 在 TE 中制备 2µg/mL 的 dsDNA 原液。试剂盒提供的 lambda DNA 标准品可以用 TE 稀释 50 倍，制成 2µg/mL 的溶液。
注 : 在某些情况下，最好使用与被测类型相似的 DNA 做标准曲线。
• 根据需要，可以从 1 ng/mL 到 1 µg/mL 制备高范围的标准曲线，也可以从 25 pg/mL 到 25 ng/mL 制备低范围的标准曲线。对于高范围或低范围曲线，可以使用 1:10 的稀释。对
于低范围曲线，将 2 µg/mL 的溶液稀释 40 倍，得到 50 ng/mL 的起始溶液。为满足本应用要求，建立了 50 pg/mL 到 1 µg/mL 的一系列标准品，稀释倍数为 1:3。
• 以每孔 100 µL 将标准品移液至 96 孔全黑微孔板中，最好重复三次。确保包含一组只有 TE ( 不含 DNA ) 的缓冲液空白孔。
• 每孔加入 Quant- iT PicoGreen 试剂工作水溶液 100µL( 这会使标准品在孔中以 1:2 稀释 )。搅拌或用振板功能混匀并在室温下避光孵育 2 - 5 分钟。
读板
• 如果使用的是 SpectraMax M 系列酶标仪，请确保紫色孔板适配器在微孔板读取抽屉的托架上。把微孔板放在抽屉里。
• 点击 SoftMax Pro 软件中的 Read 按钮。
分析数据
• 微孔板读取后，相对荧光单位 (RFUs) 将显示在孔板部分。数据将在设置模板时创建的组表中进行分析。关于来自分组表的代表性数据示例，请参见表 2。
• 模板中指定的标准品 ( 因此显示在标准组表中 ) 将自动绘制在方案的标准曲线部分。
• 默认情况下应用线性曲线拟合，但是在绘制一个很宽的动态范围内的标准曲线时，可以使用对数曲线拟合。从图形部分的 Fit 下拉菜单中选择曲线拟合。
结果
使用 Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒和 SpectraMax酶标仪检测 50 pg/mL 至 1 µg/mL 的 DNA 标准品 ( 数据来自 SpectraMax iD5 酶标仪，但其他 SpectraMax 酶标仪 给出类似的结果 )。SoftMax Pro 软件自动计算每组标准品重复的平均 RFU，标准偏差和 %CV。在 SoftMax Pro 软件中使用对数 - 对数曲线拟合绘制了一条标准曲线 ( 图 1 )。采用 96 孔微孔板格式，检测限为空白样品标准偏差的 3 倍，灵敏度可低至 50 pg/mL。这远远低于 Quant-iT PicoGreen 检测产品说明书中规定的 250 pg/ mL 的下限。图 2 为高范围 (A) 和低范围 (B) 的标准曲线。在标准品范围内线性良好 ( 图中各曲线的r2 ≥ 0.99 )。
总结
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒在 SoftMax Pro 软件的 SpectraMax 酶标仪上运行时，是一种快速、灵敏的双链 DNA检测方法。该软件的分析功能以易于阅读、用户可自定义的报告格式提供定量。一个预先配置的方案在软件中可用，以方便快速检测设置。